RAW264.7细胞是一种常用的巨噬细胞系，广泛应用于免疫学、炎症反应以及药物筛选等研究领域。为了确保实验结果的准确性与可重复性，掌握正确的细胞培养和传代技术至关重要。以下是关于RAW264.7细胞培养及传代的具体步骤和注意事项。

一、细胞培养环境准备

1. 培养基选择

RAW264.7细胞通常使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基进行培养。培养基中还需加入适量的青霉素-链霉素溶液以防止细菌污染。

2. 二氧化碳孵箱调节

将CO₂孵箱温度设定为37℃，CO₂浓度调整至5%，并保持湿度稳定在95%左右，这是维持细胞生长所需的理想条件。

3. 无菌操作台准备

实验前需对超净工作台进行彻底清洁，并用75%酒精擦拭台面及工具表面，避免外界微生物侵入。

二、细胞接种与初次培养

1. 细胞复苏

若从液氮罐中取出冷冻保存的RAW264.7细胞，应迅速将其放入37℃水浴中快速解冻，直至完全融化后立即转移至预热好的培养瓶中，加入新鲜培养基稀释。

2. 铺板密度控制

初次接种时建议将细胞密度控制在每平方厘米1×10⁴个细胞左右，这样可以保证细胞贴壁良好且后续传代顺利。

3. 观察生长状态

在接下来的几天内定期检查细胞形态是否正常。健康的RAW264.7细胞呈现圆形或椭圆形，贴壁紧密且分布均匀。

三、细胞传代方法

1. 消化分离

当细胞汇合度达到80%-90%时即可进行传代操作。首先弃去旧培养基，用PBS清洗一次，然后加入适量胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖细胞层，放置于室温下静置1-2分钟直至细胞脱落。

2. 终止消化

待细胞完全脱离瓶底后，迅速加入足量的完全培养基终止消化过程，并轻轻吹打形成单细胞悬液。

3. 计数分瓶

使用血球计数板对细胞悬液进行计数，并按需求分配到新的培养瓶中。一般情况下，推荐按照1:3的比例进行稀释传代。

4. 补充培养基

每个新瓶加入适量新鲜培养基，确保细胞能够继续健康增殖。

四、日常维护要点

- 定期更换培养基，通常每隔2-3天更换一次。

- 注意观察细胞是否存在污染迹象（如颜色变化、浑浊现象），一旦发现应及时处理。

- 避免频繁过度传代，以免影响细胞特性。

通过以上详细的步骤指导，相信您可以轻松完成RAW264.7细胞的培养与传代工作。遵循规范的操作流程不仅有助于提高实验效率，还能有效延长细胞的生命周期，为科学研究提供可靠的数据支持。